Методичні рекомендації «Порядок забору, транспортування та зберігання матеріалу для дослідження методом ПЛР»

Home »  новини »  Методичні рекомендації «Порядок забору, транспортування та зберігання матеріалу для дослідження методом ПЛР»

On April 22, 2016, Posted by , In новини, With No Comments

eeVtfbT05AcМетодичні рекомендації встановлюють загальні вимоги до організації забору, первинної обробки, зберігання та транспортування матеріалу для досліджень методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР).


МР поширюються на лабораторії (відділи, відділення) мікробіологічного профілю установ та закладів охорони здоров’я, закладів науки та освіти та інші лабораторії незалежно від їх підпорядкування та форм власності, що проводять молекулярно-біологічні дослідження з біологічними патогенними агентами (далі – БПА) I-IV груп патогенності або матеріалом, підозрілим на їх вміст.

Документ у форматі pdf можна завантажити тут: Правила забору і транспортування на ПЛР 662_2013 (2)


1. Загальні правила забору та підготовки матеріалу для дослідження методом ПЛР

Забір матеріалу повинен здійснювати кваліфікований спеціаліст, який систематично проходить інструктаж з правил забору, зберігання та транспортування біологічного матеріалу.
Забір зразків клінічного матеріалу (далі – зразки) для діагностики інфекційної патології у пацієнта по можливості проводять у період загострення в нього інфекції.

Для первинної діагностики захворювань та скринінгових досліджень слід за 3-5 днів до взяття матеріалу припинити прийняття лікарських препаратів та лікувальних процедур. При неможливості відміни, забір здійснюють в період найменшої концентрації препарату (перед введенням наступної його дози).
Зразки відбирають, дотримуючись вимог цих методичних вказівок (далі – МВ), якщо в інструкції про застосування конкретних тест-систем не вказано інакше, стерильними одноразовими інструментами в стерильні одноразові флакони, пробірки тощо. Працюють в одноразових гумових рукавичках, які змінюють після кожного пацієнта та виду матеріалу.
Зразки відбирають в пробірки або флакони з транспортним середовищем, що надається фірмою-виробником тест-систем (у випадках, коли використання транспортного середовища є необхідним). Не рекомендується використання транспортного середовища інших фірм-виробників. Пробірки або флакони, в які було відібрано зразок, щільно закривають.
При цьому не слід торкатися внутрішніх поверхонь посуду та кришок. Кожна пробірка, флакон тощо повинні бути промарковані і супроводжуватись направленням до лабораторії відповідно до форм медичної документації, затверджених наказами МОЗ України.

Перед забором епітеліальних клітин слизових оболонок необхідно
видалити з їх поверхні стерильним тампоном слиз і гній, оскільки при
зберіганні і транспортуванні клінічного матеріалу, присутність слизу та гною в
значній кількості сприяє деградації ДНК і може впливати на якість та
ефективність отримання НК.
При перенесенні зразка з пробірок, флаконів тощо в інші, слід
використовувати тільки окремі одноразові стерильні наконечники з фільтром.
З метою попередження контамінації зразків при внесенні біоматеріалу,
взятого у пацієнта зондом (тампоном, цервікальною щіточкою), в пробірку з
транспортним середовищем, необхідно дотримуватись правил асептики.
При роботі з клінічним матеріалом, відкриваючи пробірки, флакони тощо,
не можна здійснювати різких рухів і допускати розбризкування і
розпліскування, які можуть призвести до контамінації зразків і робочих
поверхонь.
Пробірки з транспортним середовищем для ПЛР-дослідження повинні
зберігатися відповідно до умов, вказаних виробником середовища.
Суворо дотримуватись правил зберігання і транспортування зразків.
Охолоджуючі елементи перед транспортуванням зразків заморожувати до
температури, вказаної виробником. Якщо інформація щодо температури їх
заморожування відсутня – при температурі -20 °С.


2. Матеріали та обладнання, необхідні для забору і попередньої обробки

матеріалу для дослідження методом ПЛР
Матеріали:
1. Одноразові поліпропіленові мікроцентрифужні пробірки з кришками, що
загвинчуються або щільно закриваються, об’ємом 1,5 мл.
2. Одноразові поліпропіленові пробірки з кришками, що загвинчуються,
об’ємом 50 мл.
3. Мікроцентрифужні пробірки із защіпкою 1,5 мл, градуйовані (пробірки типу
«епендорф» об’ємом 1,5 мл).
4. Пластиковий контейнер об’ємом 60 мл, 30 мл з ложкою.
5. Вакуумні пробірки з ЕДТА-КЗ, 2,0-6,0 мл 13×100 мм.
6. Зонд гінекологічний універсальний (полімерний ворсистий для взяття
матеріалу з уретри і цервікального каналу).
7. Цитощітка цервікальна.
8. Тампон із віскози або дакрону на пластиковій основі.
9. Одноразові наконечники з фільтром для піпеток змінного об’єму до 200 і до
1000 мкл.
10. Штативи для пробірок, мікропробірок, флаконів та штативи для
наконечників.
11. Ємності для дезінфікуючих розчинів.
12. Одноразові халати і одноразові гумові (без пудри) рукавички.
13. Стерильні компостери (пробійники) з діаметром отвору 6 мм.
Обладнання:
1. Центрифуга клінічна.
2. Мікроцентрифуга 12-16 тис. g для мікроцентрифужних пробірок об’ємом 1,5 мл.
3. Гомогенізатор.
4. Холодильники, що забезпечують наступні режими: +2 – +8 °С, -18 – -20 °С.
5. Морозильна камера -70 °С.

Перед відбором клінічного матеріалу, особливо при застосуванні
інвазивних методів, враховується можливий ризик для пацієнта і користь, а
також доцільність відбору саме даного виду біоматеріалу для цілей верифікації
клінічного діагнозу і оцінки лікувальних заходів, що проводяться або
плануються. Наприклад, ДНК деяких збудників неінформативно виявляти в
крові (Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorhoeae). Також неінформативним
буде забір матеріалу в період ремісії (для інфекцій з періодами загострень і
ремісій).
Слід пам’ятати, що вибір клінічного матеріалу для дослідження
визначається найбільш ймовірним місцем локалізації збудника. Наприклад, при
хронічному сальпінгіті (запаленні маткових труб) хламідії можуть бути не
виявлені в області шийки матки.
Найбільш інформативний матеріал для виявлення певних збудників
інфекційних хвороб, з урахуванням їх біологічних властивостей та тропності до
певних тканин, приведений у додатку 1.


3. Порядок забору, транспортування, зберігання та первинної обробки
біологічного матеріалу

3.1. Кров (плазма)
Зразки крові (плазми) використовують як для якісних, так і для кількісних
видів досліджень. Зразки сироватки крові слід використовувати тільки для
якісних досліджень. Забір крові слід проводити натщесерце або не раніше, ніж
через 3 години після прийому їжі, з ліктьової вени одноразовою голкою
(діаметр 0,8-1,1 мм) за допомогою вакуумної системи забору крові (пробірка з
кришкою бузкового кольору, яка містить EDTA-К3 ).
Після взяття крові пробірку декілька разів плавно перевертають догори
дном, щоб кров в пробірці ретельно перемішалася з антикоагулянтом, інакше
кров згорнеться і виділення ДНК/РНК стане неможливим! Після
перемішування пробірку поміщають у штатив.
Використовувати гепарин у якості антикоагулянту категорично
заборонено, оскільки він є інгібітором ПЛР!
Для отримання сироватки крові слід використовувати пробірки без
антикоагулянту.
Сухі краплини крові (СКК), висушені на паперовій картці типу 903
(Whatman, Німеччина) або аналогічній. Процедуру приготування сухих плям
крові слід проводити відповідно до рекомендацій ВООЗ
(WHO/CDS/CSR/EDC/2001.16 Рекомендації по використанню ВІЛ тестових
технологій в області епіднагляду, 2009). Для кожного пацієнта має бути
використана одна картка.
Процедура нанесення крові на папір. На кожне коло картки наносять одну
краплю крові (близько 50 мкл). Під час нанесення крові на папір, необхідно,
щоб крапля зайняла більшу частину кола. Правильно заповненою вважається
та картка, у якої всі кола повністю заповнені кров’ю. Після нанесення крові на
картку, її необхідно просушити при температурі від +18 – +25 °С протягом 4-12
год. (уникати прямих сонячних променів). Для транспортування або зберігання
картки упаковують в пакети типу zip-lock (пакети, що захищають від
підвищеної вологості) разом з осушувачами (із розрахунку 1 шт. осушувача на
1 СКК) і індикатором вологості (1 шт. на пакет). В один пакет може бути
упаковано до 10 карток СКК.
Умови зберігання і транспортування матеріалу:
Зразки цільної крові:
– при температурі +20 – +25 °С – впродовж 2 год.;
– при температурі +2 – +8 °С – впродовж 6 год. для кількісного і протягом
12 год. для якісного визначення НК.
При неможливості доставки зразків цільної крові на тестування впродовж
вказаного терміну, перевага віддається плазмі або сироватці. Необхідно
отримати ці компоненти крові і доставити їх в терміни вказані нижче.
Неприпустимо заморожування зразків цільної крові!
Висушені і упаковані картки при низьких показниках вологості можуть
зберігатися при температурі +2– +8 °С впродовж 6 місяців.
Зразки плазми та сироватки:
– при температурі +2 – +8 °С – впродовж 5 діб;
– при температурі -16 – -20 °С – впродовж року;
– при температурі -70 °С – тривало.
Допускається лише однократне заморожування-розморожування
матеріалу, тому зразки плазми або сироватки для тривалого зберігання
розділяють на невеликі (0,1-0,2 мл) порції в окремі стерильні пробірки об’ємом
1,5 мл.
Транспортування матеріалу здійснюють у спеціальному термоконтейнері з
охолоджуючими елементами, дотримуючись «холодового ланцюга».
Матеріал потребує попередньої обробки.

Плазма крові. Плазму крові отримують шляхом центрифугування пробірок з цільною
кров’ю при 800-1600 g впродовж 20 хв. при кімнатній температурі (18-22°С).
Перерахунок відносної сили центрифугування (g) у швидкість центрифугування
(об/хв.) наведений у додатку 4. Відбирають плазму в кількості не менше 1 мл
окремими наконечниками з фільтром у стерильні пробірки типу «Еппендорф»
об’ємом 1,5-2,0 мл.

Клітини крові. Клітини крові (лейкоцитарну фракцію цільної крові, лейкоцитарну плівку)
для виявлення лейкотропних вірусів (CMV, EBV, HHV6 та інших), а також
бактерій та внутрішньоклітинних паразитів відбирають після центрифугування
цільної крові і видалення плазми. Використовуючи наконечник з фільтром
акуратно збирають лейкоцитарну масу з поверхні осаду клітин в об’ємі 0,2 мл і
переносять в стерильну пробірку типу «Еппендорф» об’ємом 1,5-2,0 мл

Сироватка крові*Сироватку отримують з крові, відібраної в одноразові пробірки без антикоагулянту. Для цього кров витримують при кімнатній температурі протягом 30 хв. до повного утворення згустку або поміщають у термостат при 37 °С на 15 хв. Після цього центрифугують при 1200-2000 g впродовж 15 хв.

Переносять сироватку окремими наконечниками з фільтром у стерильні
пробірки типу «Еппендорф» об’ємом 1,5-2,0 мл.
Сироватка не повинна бути гемолізованою!

Примітка: * Сироватку допускається використовувати тільки для якісного виявлення НК
вірусів гепатитів у випадку неможливості отримати плазму; важливо пам’ятати, що при
згортанні крові частина НК вірусів (ВІЛ, HCV, HBV) залишається у кров’яному згустку.
Картки з сухими краплинами крові (СКК). Взяти стерильні компостери
(пробійники) з діаметром отвору 6 мм. Підготувати пробірки типу “Еппендорф”
об’ємом 1,5-2,0 мл. Використовуючи для кожного зразка окремий пробійник,
вибити у відповідні пробірки кола з сухими краплинами крові. Кількість
матеріалу, необхідного для дослідження, повинна бути вказана в інструкції до
тест-системи. Виділення НК з сухих плям проводять відповідно до рекомендації
виробника карток або тест-систем для екстракції НК якщо таке передбачено.


3.2. Клінічний матеріал з урогенітального тракту жінок
Матеріал для дослідження відбирають у жінок перед менструацією або
через 1-2 дні після її завершення.
Матеріал відбирають до початку проведення мануального
обстеження!
За наявності ерозії шийки матки матеріал слід відбирати на межі здорової і
зміненої тканин. Перед обстеженням на наявність збудників захворювань, що
передаються статевим шляхом (ЗПСШ), за 12 год. до забору матеріалу не
рекомендується проводити туалет статевих органів, їх обробку мазями,
присипками і т. ін., виключити впродовж 3 днів статеві контакти та
використання вагінальних свічок, мазей, тампонів, не слід спринцюватися і
приймати ванну.
Відбирати матеріал для скринінгового дослідження необхідно з кількох
різних точок. Матеріалом може бути епітелій цервікального каналу
(ендоцервікс) або вагінальні виділення. При необхідності матеріал для
дослідження (зішкріб) слід брати з уретри і ерозивно-виразкових уражень.
Відібраний матеріал з різних місць локалізації від одного пацієнта можна
поміщати в одну пробірку з транспортним середовищем.
Для діагностики запальних захворювань (цервіцит, вагініт, уретрит),
бактеріального вагінозу, скринінгового HPV-тестування матеріал з кожного
місця локалізації слід забирати в окрему пробірку. Забір матеріалу проводять
окремими для кожного із місць локалізації одноразовими стерильними
цитощітками або універсальними зондами.
Для контролю ефективності лікування забір матеріалу здійснюють не
раніше, ніж через 4-6 тижнів після завершення терапії.
Вибір клінічного матеріалу залежить від діагностичної задачі (додаток 2).

Умови зберігання і транспортування матеріалу залежать від
рекомендацій виробника транспортних середовищ. Якщо матеріал був
заморожений, то допускається однократне заморожування-розморожування
матеріалу. Транспортування матеріалу здійснюють в спеціальному
термоконтейнері з охолоджуючими елементами, дотримуючись “холодового
ланцюга”.
Умови зберігання і транспортування матеріалу можуть коригуватися,
зважаючи на інструкцію до транспортного середовища і набору реагентів для
виділення і очищення НК.


3.2.1. Зішкріб епітелію з цервікального каналу
Доступ до цервікального каналу забезпечують за допомогою одноразового
або багаторазового стерильного гінекологічного дзеркала. Забір матеріалу
проводять за допомогою цервікальної цитощітки у пробірку із спеціальним
транспортним середовищем з муколітиком об’ємом 2,0 мл.
Для дослідження на HPV необхідна достатня кількість епітеліальних
клітин, оскільки вірус є внутрішньоклітинним агентом. Допускається помірна
кількість домішок у вигляді цервікального слизу та крові. Можливий забір
матеріалу за допомогою універсального гінекологічного зонду, проте при
цьому об’єм матеріалу буде меншим, а кількість клітин для дослідження може
виявитися недостатньою.
Перед відбором матеріалу видаляють слиз та виділення піхви з поверхні
шийки матки стерильним марлевим тампоном, після цього вводять робочу
частину цитощітки в цервікальний канал і роблять два-три повні оберти за
годинниковою стрілкою. Витягують цитощітку і поміщають її робочу частину,
що містить взятий матеріал, в пробірку з транспортним середовищем. Робочу
частину цитощітки обламують не вище 1 см пластикової основи цитощітки і
залишають в пробірці з транспортним середовищем.
У ряді випадків, коли не потрібна скринінгова діагностика HPV-інфекції, у
вагітних жінок та у жінок, які не народжували для взяття матеріалу з
цервікального каналу можна використовувати універсальний зонд. Матеріал
слід забирати так, як описано вище, тільки обломлювати універсальний зонд
необхідно в місці спеціальної насічки. Для цього потрібно опустити робочу
частину зонда в пробірку з транспортним середовищем і, коли зонд досягне дна
пробірки, додатковим зусиллям зігнути тонку частину зонда зануривши в
пробірку його розширену частину до насічки, обломити стрижень і залишити
зонд в пробірці. Слід пам’ятати, що зважаючи на маленьку площу поверхні
універсального зонду, ним не завжди вдається забрати достатню кількість
клітин з поверхні слизової оболонки.
У разі неможливості обломити робочу частину цитощітки або
універсального зонда, слід максимально повно змити клінічний матеріал з їх
робочої частини у пробірку з транспортним середовищем, притиснувши її до
внутрішньої сторони пробірки і обертаючи по 5-10 разів за і проти
годинникової стрілки.
Неприпустимо використовувати ножиці для обрізання робочої частини
цитощітки або універсального зонда – це може призвести до перехресної
контамінації клінічним матеріалом і, як наслідок, отримання хибно-
позитивних результатів.
Перед проведенням процедури екстракції НК ретельно перемішують вміст
пробірки на вортексі для розчинення слизу і осаджують краплі матеріалу із
стінок пробірки і внутрішньої частини кришки центрифугуванням 800-1600 g
впродовж 5 с, після чого акуратно перемішують вміст пробірки за допомогою
піпетування.


3.2.2. Зішкріб епітелію з ендоцервіксу та екзоцервіксу
Забір матеріалу слід проводити за допомогою цервікального
комбінованого зонду для одночасного взяття матеріалу з ендо- та
екзочастин цервікса у пробірку з кришкою, що загвинчується об’ємом 5 мл зі
спеціальним транспортним середовищем.
Забирають виділення в достатній кількості. У матеріалі допускається
присутність домішок у вигляді цервікального слизу та крові.
Перед відбором матеріалу видаляють слиз із поверхні шийки матки
стерильним тампоном, вводять зонд у цервікальний канал, приклавши невелике
зусилля, поки інструмент не торкнеться цервікального каналу всією поверхнею.
Повільно провертають по одному оберту в кожну сторону так, щоб війки зонду
щільно прилягали до епітелію ендо- і екзоцервіксу.
Матеріал із урогенітального тракту потребує попередньої обробки.
Перед роботою із зразками, взятими в транспортне середовище для клінічного
матеріалу в об’ємі 0,5 мл необхідно ретельно перемішати вміст пробірок на
вортексі для повного розчинення слизу та отримання гомогенної суспензії
клітин.
Зразки зішкрібів епітелію з ендо- та екзочастин цервікса, взяті
комбінованим зондом у пробірку об’ємом 5,0 мл з транспортним середовищем
в кількості 2,0 мл, ретельно перемішують на вортексі для розчинення слизу та
отримання однорідної суспензії.
Використовуючи наконечник з фільтром відібрати 0,5 мл підготовленого
таким шляхом зразка, перенести в пробірку типу “Еппендорф” об’ємом 1,5 мл,
центрифугувати при 7000-10000 g впродовж 5 хв. Видалити 0,4 мл
супернатанту, осад клітин перемішати з його залишками.


3.2.3. Виділення з піхви
Забір матеріалу проводять за допомогою універсального зонду у пробірку
об’ємом 2 мл з транспортним середовищем, рекомендованим виробником тест-
систем.
Занурюють робочу частину зонду у вагінальне виділення задньонижнього
склепіння піхви і, обертаючи зонд, притискають його до поверхні епітелію,
максимально повно набираючи матеріал на зонд.
Переносять зонд у пробірку з транспортним середовищем. Робочу частину
зонду, яка містить досліджуваний матеріал, обламують в місці насічки і
залишають у пробірці з транспортним середовищем. Пробірку щільно
закривають кришкою, не допускаючи щілин і заминання внутрішньої частини
кришки, і маркують.


3.2.4. Виділення з уретри жінок
Забір виділень з уретри проводять за допомогою універсального зонду у
пробірку об’ємом 2,0 мл з транспортним середовищем, рекомендованим
виробником тест-систем.
У пробі допускається присутність незначних домішок у вигляді слизу і
крові.
Перед взяттям матеріалу проводять туалет зовнішнього отвору уретри
тампоном, змоченим стерильним фізіологічним розчином для видалення
виділень із піхви. Вводять робочу частину зонду в уретру, кількома
обертальними рухами забирають виділення уретри на робочу частину зонду і
переносять його у пробірку з транспортним середовищем. Робочу частину
зонду, яка містить досліджуваний матеріал, обламують в місці насічки і
залишають в пробірці з транспортним середовищем.
Пробірку щільно закривають кришкою, не допускаючи щілин і заминання
внутрішньої частини кришки, і маркують.

3.3. Клінічний матеріал з урогенітального тракту чоловіків
Для діагностики урогенітальних інфекцій у чоловіків досліджують зішкріб
епітеліальних клітин уретри, першу порцію сечі, секрет передміхурової залози
та/або еякулят (сперму).
У більшості випадків для діагностики гострого уретриту або загострення
хронічного уретриту досліджують зішкріб епітеліальних клітин передньої
частини уретри.
При хронічних, малосимптомних запальних процесах, при простатиті
додатково досліджують секрет передміхурової залози або першу порцію сечі
після масажу простати.
При діагностиці чоловічого безпліддя додатково досліджують еякулят
(сперму).
Для діагностики інфекцій верхніх відділів репродуктивних органів
досліджують секрет передміхурової залози та/або еякулят (сперму).
При скринінгових дослідженнях на ЗПСШ доцільно використовувати
першу порцію сечі як матеріал, отриманий неінвазивним шляхом.
Умови зберігання і транспортування матеріалу можуть коригуватися,
відповідно до інструкції з використання транспортного середовища і набору
реагентів для виділення і очищення НК. Якщо матеріал був заморожений, то
допускається однократне заморожування-розморожування матеріалу.
Транспортування матеріалу здійснюють у спеціальному термоконтейнері з
охолоджуючими елементами.
Вибір клінічного матеріалу залежить від діагностичної задачі (додаток 3).


3.3.1. Виділення з уретри чоловіків, зішкріб епітеліальних клітин уретри
чоловіків
Забір виділень із уретри здійснюють за допомогою універсального зонду у
пробірку об’ємом 2 мл з транспортним середовищем, рекомендованим
виробником тест-систем. Виділення відбирають в достатній кількості. В пробі
допускається присутність домішок у вигляді слизу, крові та гною.
Перед взяттям матеріалу з уретри обробляють голівку статевого члена в
місці зовнішнього отвору уретри тампоном, змоченим стерильним
фізіологічним розчином. Проводять масаж уретри. При наявності виділень, які
вільно стікають з уретри, видаляють їх сухим тампоном. Вводять зонд в уретру
на глибину 1-2 см. Кількома обертальними рухами відбирають епітеліальні
клітини і переносять зонд у пробірку зі спеціальним транспортним
середовищем. Робочу частину зонду, що містить досліджуваний матеріал,
обламують і залишають у пробірці з транспортним середовищем. Пробірку
щільно закривають, не допускаючи щілин і заминання внутрішньої частини
кришки, та маркують.
Умови зберігання і транспортування матеріалу залежать від
рекомендацій виробника транспортних середовищ.


3.3.2. Секрет передміхурової залози
Перед отриманням секрету простати голівку статевого члена обробити
стерильним ватним тампоном.
Секрет простати слід збирати після попереднього масажу простати через
пряму кишку. Лікар проводить масаж з натисканням кількома енергійними
рухами від основи до верхівки. Після закінчення масажу передміхурової залози
її секрет у кількості 0,5-1 мл зібрати в одноразову стерильну суху пробірку
типу “Еппендорф” об’ємом 2,0 мл.
Пробірку щільно закрити кришкою, не допускаючи щілин і заминання
внутрішньої частини кришки та промаркувати.
При неможливості отримати секрет відразу після масажу простати – слід
зібрати першу порцію сечі, у якій міститься секрет передміхурової залози, у
кількості 20-30 мл (див. правила забору сечі).
Умови зберігання і транспортування матеріалу:
– при кімнатній температурі – впродовж 6 год.;
– при температурі +2 – +8 °С – впродовж 1 доби;
– при температурі -20 °С – впродовж 1 тижня;
– при температурі -70 °С – тривало.


3.3.3. Сперма
Забір сперми здійснюють в спеціальний сухий стерильний флакон
об’ємом 50 мл.
Умови зберігання і транспортування матеріалу:
– при кімнатній температурі – впродовж 6 год.;
– при температурі +2 – +8 °С – впродовж 1 доби;
– при температурі -20 °С – впродовж 1 тижня;
– при температурі -70 °С – тривало.
Матеріал потребує попередньої обробки. Безпосередньо перед
виділенням НК, використовуючи наконечник з фільтром, переносять 0,05 мл
сперми в стерильну одноразову пробірку об’ємом 1,5 мл і додають 0,15 мл
транспортного середовища, ретельно перемішують пробу на вортексі.


3.4. Сеча
Для дослідження відбирають першу порцію вранішньої сечі в кількості
15-25 мл в спеціальний сухий стерильний флакон або контейнер на 50-60 мл.
Жінки. Збір сечі проводиться після ретельного туалету зовнішніх статевих
органів, щоб в сечу не потрапили виділення з них. Бажано закладати тампон у
піхву перед забором матеріалу для попередження контамінації сечі
виділеннями із піхви. Також не слід проводити забір сечі під час менструації.
Чоловіки. До забору сечі проводять туалет зовнішніх статевих органів.
При сечовипусканні необхідно повністю відтягнути шкірну складку, звільнити
зовнішній отвір сечовивідного каналу.
Матеріал потребує попередньої обробки. Збовтують флакон з сечею.
Переносять 1 мл сечі, використовуючи наконечник з фільтром, у стерильні
одноразові пробірки типу “Еппендорф” об’ємом 1,5 мл. Центрифугують 5 хв.
при 10000 g. Використовуючи вакуумний відсмоктувач з колбою-пасткою,
повністю видаляють супернатант, не захоплюючи осад. До осаду додають
транспортне середовище до кінцевого об’єму 0,2 мл, ретельно перемішують
вміст на вортексі.
При дослідженні на Leptospira spp. можливе також послідовне
концентрування: спочатку 20 мл сечі центрифугувати 10 хв. при 9000 g.
Потім осад і 1 мл надосадової сечі центрифугувати 10 хв. при 11000 g.
Умови зберігання і транспортування матеріалу та попередньо
оброблених зразків.
– при температурі +2 – +8 °С – впродовж 1 доби;
– при температурі -20 °С – впродовж 1 тижня;
– при температурі -70 °С – тривало.
Транспортування матеріалу здійснюють в спеціальному термоконтейнері з
охолоджуючими елементами.
Допускається тільки однократне заморожування-розморожування
матеріалу.


3.5. Фекалії
Використовують фекалії (кал) після природної дефекації, які збирають в
чистий одноразовий контейнер з ложечкою, вмонтованою в кришку, що
загвинчується. Збирають фекалії на чисту поверхню, в якості якої може бути
використаний чистий новий лист з поліетилену або паперу. При використанні
судна, його попередньо ретельно промивають з милом та губкою, ополіскують
багатократно водопровідною водою, а потім обдають окропом та охолоджують.
У немовлят проби фекалій забирають з підгузка. Невелику кількість 1,0-3,0 г
(1,0-3,0 мл) забирають з 4-6 різних місць ложечкою, вмонтованою в кришку
контейнеру, або іншим стерильним предметом, що підходить для цього і
поміщають у контейнер. Ретельно закривають кришку. Не рекомендується
наповнювати контейнер до верху.
Матеріал потребує попередньої обробки. При дослідженні нативних
фекалій без попереднього заморожування слід приготувати фекальну суспензію
(при водянистій консистенції фекалій у вигляді прозорої рідини фекальну
суспензію не готують).
Приготування фекальної суспензії
У відповідну пробам кількість мікроцентріфужних пробірок (об’ємом 1,5-
2,0 мл) внести 0,8 мл фосфатного буферу (або стерильного ізотонічного
розчину натрію хлориду).
У кожну пробірку окремим наконечником з фільтром (або одноразовими
лопатками) внести 0,2 мл (0,2 г) фекалій і ретельно ресуспендувати на вортексі
до утворення гомогенної суспензії.
При неможливості дослідження матеріалу впродовж доби та/або
необхідності тривалого зберігання до суспензії фекалій у фосфатному буфері
(або стерильному ізотонічному розчині натрію хлориду) додають гліцерин в
кінцевій концентрації 10-15 %. Підготовлені таким чином проби заморожують
після ретельної гомогенізації та експозиції з гліцерином впродовж 30-40 хв.
Приготування бактеріальної фракції фекалій для виявлення бактеріальних
агентів
Для приготування бактеріальної фракції фекалій можна використовувати
фекалії водянистої консистенції, щойно приготовлену суспензію фекалій або
суспензію, що піддавалася заморожуванню з гліцерином.
Пробірки із суспензією (водянистими фекаліями) центрифугують при
7000-12000 g впродовж 5 хв.
Окремим наконечником з фільтром з кожної пробірки відбирають 0,05 мл
бактеріальної фракції фекалій (верхня біло-жовта частина утвореного осаду).
При відсутності осаду або біло-жовтого граничного шару між осадом і
супернатантом відбирають 0,1 мл з дна пробірки або з межі осаду і
супернатанту відповідно. Відібрану частину проби, що містить високу
концентрацію бактерій, переносять у нову пробірку, що містить 0,8 мл
фосфатного буфера або стерильного ізотонічного розчину натрію хлориду.
Ретельно ресуспендують осад на вортексі і центрифугують при 7000-12000
g впродовж 5 хв.
Супернатант видаляють і осад ресуспендують на вортексі в 0,3 мл
фосфатного буферу (або стерильного ізотонічного розчину натрію хлориду).
Приготування освітленого екстракту фекалій для виявлення вірусних
агентів
Для приготування освітленого екстракту фекалій використовують фекалії
водянистої консистенції, свіжоприготовлену суспензію фекалій або суспензію,
що піддавалася заморожуванням з гліцерином.
Завись фекалій інтенсивно гомогенізують на вортексі.
Освітлюють отриману суспензію шляхом центрифугування при 10000 g
впродовж 5 хв.
Супернатант (0,1 мл) змішують з ОКО (0,1 мл) у співвідношенні 1:1 і
використовують безпосередньо для виділення РНК.
При необхідності зберігання супернатант відбирають в окрему одноразову
пробірку.
Умови зберігання і транспортування матеріалу:
Зразки нативних фекалій:
– при кімнатній температурі – впродовж 6 год.;
– при температурі 2 – 8 °С – впродовж 3 діб;
Фекальна суспензія з гліцерином, бактеріальна фракція і освітлений
фекальний екстракт:
– при температурі -20 °С – впродовж 1 тижня;
– при температурі -70 °С – тривало.
Транспортування матеріалу здійснюють у спеціальному термоконтейнері
з охолоджуючими елементами.
Допускається лише однократне заморожування-розморожування
матеріалу.


3.6. Спинномозкова рідина
Спинномозкову рідину (ліквор) слід відбирати за допомогою одноразових
голок, в одноразові пластикові сухі пробірки об’ємом 2,0 мл в кількості не
менше 1,0 мл.
Пробірки щільно закрити кришкою, не допускаючи щілин і заминання
внутрішньої частини кришки, та промаркувати.
Умови зберігання і транспортування матеріалу:
– при температурі +2 – +8 °С – впродовж 1 доби;
– при температурі -20 °С – впродовж 1 тижня;
– при температурі -70 °С – тривало.
Допускається лише однократне заморожування-розморожування
матеріалу.
Транспортування матеріалу здійснюють в спеціальному термоконтейнері
з охолоджуючими елементами .
Матеріал потребує попередньої обробки. Для концентрування клітин, що
містять віруси і бактерії при деяких інфекційних/паразитарних захворюваннях
(лептоспіроз, бореліоз, токсоплазмоз тощо) центрифугують 1,0 мл ліквору при
8000-9000 g, досліджують осад і 100,0 мкл супернатанту.


3.7. Слізна рідина
Матеріал слід забирати за допомогою одноразових пластикових піпеток в
об’ємі не менше 0,5 мл в одноразові сухі стерильні пробірки типу “Еппендорф”
об’ємом 2,0 мл. Для посилення сльозовиділення провести провокацію
сльозогінною речовиною (зазвичай використовується нашатирний спирт).
Пробірку щільно закрити кришкою, не допускаючи щілин і заминання
внутрішньої частини кришки, та промаркувати.
Умови зберігання і транспортування матеріалу:
– при температурі +2 – +8 °С – впродовж 1 доби;
– при температурі -20 °С – впродовж 1 тижня;
– при температурі -70 °С – тривало.
Допускається лише однократне заморожування-розморожування
матеріалу.
Транспортування матеріалу здійснюють у спеціальному термоконтейнері
з охолоджуючими елементами.


3.8. Виділення кон’юнктиви
За 24 години не слід застосовувати медпрепарати (краплі, мазі). Перед
забором матеріалу не можна умиватися і користуватися косметичними
засобами.
Матеріал відбирають сухим стерильним тампоном із віскози або дакрону
на пластиковій основі під місцевою анестезією (2 краплі розчину дикаїну).
Відтягнувши нижню повіку, обертальними рухами, провести тампон 4-5 разів
по кон’юнктиві, захоплюючи зовнішній і внутрішній куточки очей.
Після взяття матеріалу тампон помістити у стерильну одноразову пробірку
об’ємом 2,0 мл з транспортним середовищем.
Зануривши робочу частину тампону у транспортне середовище, обережно
обламати пластиковий стрижень на відстані не більше 0,5 см від робочої
поверхні і залишити робочу частину з матеріалом у транспортному середовищі.
Пробірку щільно закрити кришкою, не допускаючи щілин і заминання
внутрішньої частини кришки, та промаркувати.
Умови зберігання і транспортування матеріалу:
– при кімнатній температурі – впродовж 6 год.;
– при температурі +2 – +8°С – впродовж 3 діб;
– при температурі -20 °С – впродовж 1 тижня;
– при температурі -70 °С – тривало.
Допускається лише однократне заморожування-розморожування
матеріалу
Транспортування клінічного матеріалу здійснюють в спеціальному
термоконтейнері з охолоджуючими елементами.


3.9. Клінічний матеріал з респіраторного тракту людини

3.9.1. Мазок із порожнини носа
Мазки (слиз) з порожнини носа відбирають сухими стерильними
тампонами із віскози або дакрону на пластиковій основі. Для обох носових
ходів використовують один тампон, який спочатку вводять в один, а потім в
інший носовий хід по зовнішній стінці носу на глибину 2-3 см до нижньої
раковини. Потім тампон злегка опустити донизу, ввести в нижній носовий хід
під нижню носову раковину, зробити обертальний рух і видалити вздовж
зовнішньої стінки носа.
Після отримання матеріалу робочу частину тампону помістити у стерильну
одноразову пробірку об’ємом 1,5-2,0 мл із кришкою з транспортним
середовищем в об’ємі 0,5 мл. Після отримання матеріалу робочу частину
тампону помістити у 0,5 мл транспортного середовища в стерильну одноразову
пробірку об’ємом 1,5-2,0 із кришкою. Занурити робочу частину тампону в
транспортне середовище, обережно обламати пластиковий стрижень на відстані
не більше 0,5 см від робочої частини і залишити робочу частину тампону з
матеріалом у транспортному середовищі.
Пробірку щільно закрити кришкою, не допускаючи щілин і заминання
внутрішньої частини кришки, та промаркувати.

Умови зберігання і транспортування матеріалу:
– при кімнатній температурі – впродовж 6 год.;
– при температурі +2 – +8 °С – впродовж 3 діб;
– при температурі -20 °С – впродовж 1 тижня;
– при температурі -70 °С – тривало.
Допускається тільки однократне заморожування-розморожування
матеріалу.
Транспортування клінічного матеріалу здійснюють в спеціальному
термоконтейнері з охолоджуючими елементами.


3.9.2. Змиви із слизової порожнини носа
Забір матеріалу проводять в положенні хворого сидячи з відхиленою назад
головою. Для отримання змиву із порожнини носа в обидва носові ходи по
черзі за допомогою зонду або одноразового шприца ввести по 3,0-5,0 мл
теплого стерильного ізотонічного розчину натрію хлориду. Промивну рідину з
обох носових ходів збирати через стерильну лійку в одну стерильну пробірку.
Не допускається повторне використання лійки без попереднього
автоклавування.
Умови зберігання і транспортування матеріалу:
– при температурі +2-8 °С – впродовж 6 год.;
– при температурі -20 °С – впродовж 1 тижня;
– при температурі -70 °С – тривало.
Допускається тільки однократне заморожування-розморожування
матеріалу.
Транспортування клінічного матеріалу здійснюють у спеціальному
термоконтейнері з охолоджуючими елементами.


3.9.3. Мазки з ротоглотки

Забір мазка проводиться натщесерце або не раніше, ніж через 2-4 год. після

прийому їжі. Матеріал слід забирати сухими стерильними тампонами із віскози
або дакрону на пластиковій основі обертальними рухами з поверхні мигдаликів,
піднебінних дужок і задньої стінки ротоглотки.
Після отримання матеріалу робочу частину тампону помістити в
стерильну одноразову пробірку з кришкою об’ємом 1,5-2,0 мл із транспортним
середовищем в об’ємі 0,5 мл. Після отримання матеріалу робочу частину
тампону помістити в 0,5 мл транспортного середовища у стерильну одноразову
пробірку з кришкою об’ємом 1,5-2,0 мл. Занурити робочу частину тампону в
транспортне середовище, обережно обломити пластиковий стрижень на
відстані не більше 0,5 см від робочої частини, залишити робочу частину у
транспортному середовищі.
Пробірку щільно закрити кришкою, не допускаючи щілини і заминання
внутрішньої частини кришки, та промаркувати.

Умови зберігання і транспортування матеріалу:
– при кімнатній температурі – впродовж 6 год.;
– при температурі +2 – +8 °С – впродовж 3 діб;
– при температурі -20 °С – впродовж 1 тижня;
– при температурі -70 °С – тривало.
Допускається тільки однократне заморожування-розморожування
матеріалу.
Транспортування клінічного матеріалу здійснюють в спеціальному
термоконтейнері з охолоджуючими елементами.


3.9.4. Змиви з ротоглотки
Перед отриманням матеріалу провести попереднє полоскання порожнини
рота водою. Потім ретельно прополоскати ротоглотку (впродовж 10-15 с) за
допомогою 10 мл ізотонічного розчину натрію хлориду. Рідину слід зібрати в
стерильний флакон об’ємом 50 мл.
Умови зберігання і транспортування матеріалу:
– при кімнатній температурі – впродовж 6 год.;
– при температурі +2 – +8 °С – впродовж 3 діб;
– при температурі -20 °С – впродовж 1 тижня;
– при температурі -70 °С – тривало.
Допускається лише однократне заморожування-розморожування
матеріалу.
Транспортування клінічного матеріалу здійснюють в спеціальному
термоконтейнері з охолоджуючими елементами.


3.9.5. Мокротиння
Мокротиння збирають вранці натщесерце. Перед збором матеріалу пацієнт
має почистити зуби і прополоскати рот і горло кип’яченою водою.
Збирати мокротиння слід у кількості не менше 1,0 мл, в одноразові
стерильні флакони з широким горлом, які загвинчуються кришками, об’ємом
не менше 50,0 мл.
Умови зберігання і транспортування матеріалу:
– при кімнатній в температурі – впродовж 6 год.;
– при температурі +2 – +8 °С – впродовж 3 діб;
– при температурі -20 °С – впродовж 1 тижня;
– при температурі -70 °С – тривало.
Допускається лише однократне заморожування-розморожування
матеріалу.
Транспортування клінічного матеріалу здійснюють в спеціальному
термоконтейнері з охолоджуючими елементами
Матеріал потребує попередньої обробки. Перед виділенням НК
необхідно провести розрідження мокротиння, використовуючи розчин
“Муколізин”. У градуйований флакон з мокротинням додати ” Муколізин” у
співвідношенні 5:1 (5 частин “Муколізину” до 1 частини мокротиння),
орієнтуючись по градуюванню ємності, та стерильні скляні намистини (5-8
штук). У процесі розрідження мокротиння (20-30 хв.) ємність періодично
струшують. Потім піпеткою, використовуючи наконечник з фільтром,
відбирають 1,0 мл розрідженої мокроти, поміщають в пробірку з кришкою, що
загвинчується, або в мікроцентрифужну пробірку з замком об’ємом 1,5-2,0 мл і
центрифугують при 5000-7000 g впродовж 10 хв. Видаляють 0,8 мл
супернатанту, осад клітин перемішують з його залишками.
Допускається виділення ДНК/РНК з 0,1 мл розрідженої мокроти без стадії
центрифугування.


3.9.6. Бронхоальвеолярний лаваж/промивні води бронхів
Забір матеріалу здійснюють в одноразові пробірки об’ємом 50 мл, які
щільно загвинчуються.
Умови зберігання і транспортування матеріалу та попередньо
оброблених проб:
– при температурі +2-8 °С – впродовж 1 доби;
– при температурі -20 °С – впродовж 1 тижня;
– при температурі -70 °С – тривало.
Допускається тільки однократне заморожування-розморожування
матеріалу.
Транспортування клінічного матеріалу здійснюють у спеціальному
термоконтейнері з охолоджуючими елементами.
Матеріал потребує попередньої обробки. Промивні води бронхів або
бронхоальвеолярний лаваж необхідно перемішати, перевертаючи пробірку
декілька разів. Автоматичною піпеткою, використовуючи наконечник з
фільтром, відібрати 1,0 мл клінічного матеріалу, помістити в пробірку типу
“Еппендорф” з кришкою, що загвинчується, або пробірку з замком об’ємом 1,5
мл і центрифугувати при 7000 g впродовж 10 хв. Видалити 0,9 мл супернатанту,
осад клітин перемішати з його залишками.


3.10. Слина
Перед відбором слини слід виключити прийом їжі продовж 4-х годин,
провести триразове полоскання порожнини рота фізіологічним розчином.
Слину забирати в одноразові сухі стерильні пробірки об’ємом 2 мл в кількості
не менше 1,0 мл.
Пробірку щільно закрити кришкою, не допускаючи щілини і заминання
внутрішньої частини кришки, та промаркувати.
Умови зберігання і транспортування матеріалу:
– при кімнатній температурі – впродовж 6 год.;
– при температурі +2 – +8 °С – впродовж 1 доби;
– при температурі -20 °С – впродовж 1 тижня;
– при температурі -70 °С – тривало.
Допускається лише однократне заморожування-розморожування
матеріалу.
Транспортування клінічного матеріалу здійснюють у спеціальному
термоконтейнері з охолоджуючими елементами.


3.11. Пунктат бубону
Забір матеріалу здійснюють стерильним шприцом. Якщо бубон має шкіру
(бубон, що не розкрився), то її попередньо слід протерти спиртом. Пункцію
бубону проводять як в його центрі, так і на периферії. З бубону, що розкрився,
матеріал забирають в місцях із збереженою тканиною, а також беруть
виділення з бубону. Досліджуваний матеріал в кількості 0,1-0,3 мл поміщають в
пробірку із транспортним середовищем, рекомендованим виробником тест-
систем.
Умови зберігання і транспортування матеріалу:
– при температурі +2 – +8 °С — впродовж 1 доби;
– при температурі -20 °С — впродовж 1 місяця;
– при температурі -70 °С — тривало.
Допускається лише однократне заморожування-розморожування
матеріалу.
Попередня обробка проб не потрібна.


3.12. Матеріал із везикул і пустул
Перед відбором матеріалу елементи шкірної висипки очищають ватним
тампоном, змоченим ефіром або спиртом, потім проколюють їх біля основи
стерильною голкою або тонким капіляром пастерівської піпетки. Для
прискорення надходження матеріалу елемент зверху притискають пінцетом.
Кірку або верхню частину везикул відділяють від шкіри стерильними голкою
або скальпелем. Досліджуваний матеріал поміщають в пробірку з транспортним
середовищем.
Умови зберігання і транспортування матеріалу:
– при кімнатній температурі — впродовж 6 год.;
– при температурі +2 – +8 °С — впродовж 3 діб;
– при температурі -20 °С — впродовж 1 тижня;
– при температурі -70 °С — тривало.
Допускається лише однократне заморожування-розморожування матеріалу
Транспортування клінічного матеріалу здійснюють у спеціальному
термоконтейнері з охолоджуючими елементами.
Попередня обробка проб не потрібна.


3.13. Біопсійний та аутопсійний матеріал
Матеріал забирають із зони очікуваного місцезнаходження збудника
інфекції, із пошкодженої тканини або з граничної з пошкодженням ділянки.
Шматочки тканини діаметром не більше 5 мм поміщають в одноразові
стерильні пробірки типу “Еппендорф” об’ємом 2,0 мл, що містять 0,5 мл
транспортного середовища.
Пробірку щільно закрити кришкою, не допускаючи заминання внутрішньої
частини кришки, і промаркувати.
Умови зберігання і транспортування матеріалу:
– при кімнатній температурі – впродовж 6 год.;
– при температурі +2 – +8 °С – впродовж 3 діб;
– при температурі -20 °С – впродовж 1 тижня;
– при температурі -70 °С – тривало
Допускається лише однократне заморожування-розморожування матеріалу
Транспортування матеріалу здійснюють у спеціальному термоконтейнері з
охолоджуючими елементами.
Матеріал потребує попередньої обробки.
Мікробіоптати (пунктати)/мікроаутоптати печінки, селезінки,
передміхурової залози, шлунково-кишкового тракту, шийки матки тощо,
поміщені в мікропробірки з кришками, що загвинчуються або пробірки об’ємом
1,5 мл із замком, які містять 0,1 мл транспортного середовища, попередньої
обробки не потребують. Виділення НК проводять згідно з інструкцією до
комплекту для виділення.
Макробіоптати/макроаутоптати
Для виявлення вірусних агентів кусочки тканин масою 0,1-1 г поміщають в
охолоджену фарфорову ступку и додають охолоджений ізотонічний розчин
хлориду натрію в об’ємі 0,5-1,0 мл. Подрібнюють стерильними ножицями з
наступним розтиранням товкачиком. Через ватний тампон стерильним
наконечником з фільтром відбирають супернатант (0,1-0,2 мл) в стерильні
мікропробірки.
Для виявлення бактеріальних агентів процес підготовки макробіоптатів
(макроаутоптатів) аналогічний, тільки ступку і ізотонічний розчин не
охолоджують.
За іншим способом біоптат безпосередньо перед виділенням НК
поміщають в рідкий азот, потім акуратно подрібнюють його товкачиком в
попередньо охолодженій рідким азотом фарфоровій ступці. Зважують 100 мг
кусочків тканини і розтирають їх в ступці в рідкому азоті до порошку. Потім
для виділення РНК порошок переносять в гомогенізатор і далі дотримуються
інструкції з виділення РНК. Для виділення ДНК до отриманого порошку
додають рівний об’єм стерильного фізіологічного розчину (0,1 мл), ретельно
перемішують і відбирають необхідний об’єм матеріалу відповідно до інструкції
з виділення ДНК.
Порцеляновий посуд, а також гомогенізатори повинні бути попередньо
оброблені хромпіком і простерилізовані. При гомогенізації декількох зразків
необхідно після кожної проби протирати поверхню столу дезінфікуючим
розчином, потім водою і 70 % етанолом і міняти перед обробкою наступної
проби рукавички.


4. Порядок забору, транспортування, зберігання та первинної обробки проб

4.1. Кліщі, комарі та ектопаразити (воші та блохи)
Після забору і доставки матеріалу до лабораторії комарів, кліщів, бліх і
вошей необхідно знерухоміти шляхом нанесення краплі ефіру на ватно-марлеву
пробку. Після визначення виду і статі матеріал може бути об’єднаний у пули в
залежності від виду, статі, місця і дати збору і поміщений у сухі чисті пробірки
об’ємом 1,5-2,0 мл. Число екземплярів у пулі не має перевищувати для комарів
– 25, кліщів голодних – 5, ситих кліщів – 1, бліх і вошей – 30.
Умови зберігання і транспортування матеріалу і попередньо
оброблених проб.
Матеріал після розбору і формування проб:
– при температурі -20 °С – впродовж 1 місяця;
– при температурі -70 °С – тривало.
Оброблений матеріал (після гомогенізації і освітлення) зберігається
тривало при температурі -70 °С.
Допускається тільки однократне заморожування-розморожування
матеріалу.
Живих членистоногих транспортують при температурі не нижче -10 °С у
спеціальному термоконтейнері з охолоджуючими елементами, після
заморожування – при температурі не вище -16 °С.
Матеріал потребує попередньої обробки.
Кліщів слід помістити в мікроцентрифужні пробірки об’ємом 1,5-2,0 мл,
куди внести 1 мл 96 % етанолу, струсити на вортексі і центрифугувати
впродовж 3-5 с при 2000 g для видалення крапель з кришки пробірки.
За допомогою вакуумного відсмоктувача окремими наконечниками для
кожної проби видалити спирт з пробірки.
Внести в пробірку 1 мл 0,15 М розчину хлориду натрію, струсити пробірку
і осадити краплі з кришки пробірки центрифугуванням впродовж 3-5 с при 2000
g.
За допомогою вакуумного відсмоктувача окремими наконечниками для
кожної проби видалити розчин хлориду натрію з пробірки.
Перенести кліщів у стерильну порцелянову ступку, додати 0,7 мл 0,15 М
розчину хлориду натрію і гомогенізувати пробу.
Наконечником з фільтром перенести пробу в мікроцентрифужну пробірку
об’ємом 1,5-2,0 мл і центрифугувати при 3000 об./хв. впродовж 1 хв. для
освітлення проби.
РНК і ДНК слід виділяти з 0,1 мл супернатанту.
При виділенні РНК і ДНК з комарів, бліх і вошей необхідно
використовувати дану методику обробки проб за винятком етапів відмивання
в 96 % етанолі і 0,15 М розчині хлориду натрію. Комах і комарів слід відразу
гомогенізувати у стерильній ступці у 0,15 М розчині хлориду натрію.


4.2. Харчові продукти для визначення бактеріальних та вірусних патогенів
Забір проб здійснюють відповідно до діючих нормативних документів з
дотриманням правил асептики у стерильні широкогорлі банки за допомогою
стерильної ложки, пінцета або ножа.
Умови зберігання і транспортування матеріалу:
– при температурі +2 – +8 °С — впродовж 1 доби;
– при температурі -20 °С — впродовж 1 місяця;
– при температурі -70 °С — тривало.
Допускається лише однократне заморожування-розморожування
матеріалу.
Матеріал потребує попередньої обробки.
Для виявлення бактеріальних патогенів (Campilobacter, Salmonella,
Shigella, діареєгенні E.coli тощо) проби харчових продуктів засівають на
середовища попереднього збагачення відповідно до нормативних документів та
інкубують в термостаті при відповідній температурі. Для виділення НК
використовують 0,1-0,2 мл середовища попереднього збагачення.
Для виявлення НК вірусів тверді харчові продукти в кількості 1,0-10,0 г
поміщають в стерильну ступку, додають 0,9 %-й розчин натрію хлориду в
співвідношенні 1:10 і розтирають до гомогенного стану. Відстоюють і через
фільтрувальний папір відбирають супернатант, з якої виділяють НК. Рідкі
харчові продукти в об’ємі 0,2 мл переносять у мікроцентрифужну пробірку
об’ємом 1,5 мл або 2,0 мл для виділення НК.


4.3. Змиви з поверхонь
Змиви відбирають за допомогою тампонів із віскози або дакрону на
пластиковій основі. Перед відбором змивів, тампони змочують стерильним
фізіологічним розчином або ТЕ-буфером. Після забору змивів тампон
поміщають у мікропробірку із 300-400 мкл ТЕ-буферу. Обертальними рухами
змивають з тампону відібраний матеріал протягом 10-15 сек., уникаючи
розбризкування розчину. Відтискають надлишок рідини з тампону об стінки
пробірки і видаляють тампон.
Умови зберігання і транспортування матеріалу:
– при температурі +2 – +8 °С — впродовж 1 доби;
– при температурі -20 °С — впродовж 1 місяця;
– при температурі -70 °С — тривало.
Допускається лише однократне заморожування-розморожування
матеріалу.
Матеріал потребує попередньої обробки. Одержану суспензію
центрифугують при 8000 g протягом 1 хв. Супернатант відбирають
наконечником з фільтром в мікропробірку 1,5 мл. Для виділення НК
використовують 0,1-0,2 мл супернатанту.


4.4. Ґрунт, фураж, трава, підстилка
Проби ґрунту з місць вірогідного обсіменіння патогенними
мікроорганізмами (місць вимушеного забою худоби, стоянок і водопою тварин)
беруть з квадратних ділянок, з сторонами не більше 4 м, в кількості 20,0-30,0 г
на глибині до 15 см по кутах та в центрі ділянок, на території скотомогильників
— на глибині до 2 м за допомогою ґрунтових бурів через кожні 25 см. При
цьому верхній шар ґрунту (2-3 см) знімають.
Проби фуражу беруть як з поверхневого шару, так і з глибинних шарів
фуражу рівномірно по всій площині — не менше 100,0 г на 4 м
поверхні при незатареному типі зберігання, але не менше 5 проб від кожної партії. З
брикетованого корму зрізають верхній шар брикету. Забір проб проводять
сухим стерильним пробним щупом. Проби грубих кормів (сіно, солома) беруть
з різних місць скирти за допомогою ножиць і пінцета з розрахунку одна проба
(40,0 г) на 4 м2 площі скирти. Відібрані наважки сіна і соломи подрібнюють за
допомогою ножиць і пінцета на аркуші паперу, потім поміщають в стерильні
скляні банки, закривають стерильними кришками. Допускається
використовувати поліетиленові пакети. Після взяття проб від кожного об’єкту
(партії) щуп очищують та обпалюють.
Зелену масу беруть як і грубі корми, збільшивши масу первинної проби до
100,0 г. Зрізану ножицями масу , поміщають пінцетом в пробірку або в банку.
Проби силосу, що зберігається в ямах (траншеях), беруть як і проби
ґрунту, такий що дістаний з траншеї – як проби зеленої маси.
Маса середньої проби, що доставляється до лабораторії, повинна бути не
більше 500,0 г.
Умови зберігання і транспортування матеріалу:
– при температурі +2 – +8 °С — впродовж 1 доби;
– при температурі -20 °С — впродовж 1 місяця;
– при температурі -70 °С — тривало.
Допускається лише однократне заморожування-розморожування матеріалу
Матеріал потребує попередньої обробки.
До досліджуваного матеріалу додають 0,9 %-й розчин натрію хлориду 1:10,
ретельно перемішують впродовж 15 хв., відстоюють 10 хвилин для осідання
великих часточок. Супернатант дробно центрифугують: спочатку впродовж 2-3
хв. при 2000 g, потім – центрифугують 15 хв. при 10000 g. Осад ресуспендують
у 0,2-0,5 мл дистильованої води.


4.5. Вода, стоки
Забір води здійснюють у відповідності до вимог методичних вказівок
«Санітарно-вірусологічний контроль водних об’єктів», затверджених наказом
МОЗ України від 30.05.2007 № 284, «Санітарно-мікробіологічний контроль
якості питної води», затверджених наказом МОЗ України від 03.02.2005 № 60,
ДСТУ ISO 5667-6-2001 «Настанови щодо відбирання проб води з річок та
інших водотоків», ДСТУ ISO 5667-11-2005 «Настанови щодо відбирання проб
підземних вод» тощо.
Умови зберігання і транспортування матеріалу:
– при температурі +2 – +8 °С — впродовж 1 доби;
– при температурі -20 °С — впродовж 1 місяця;
– при температурі -70 °С — тривало.
Допускається лише однократне заморожування-розморожування
матеріалу.
Проби зберігають до дослідження при +4 °С не більше 24 год. При
температурі -20 °С їх можна зберігати протягом 1 року. При необхідності
багатократного дослідження, пробу ділять на декілька порцій, щоб уникнути
повторного заморожування.
Матеріал потребує попередньої обробки.
Для виявлення бактеріальних агентів і збудників мікозів підготовку проб
здійснюють методом дробного центрифугування або вакуумної фільтрації на
фільтри з розмірами пор 0,45 і 0,65; 0,8; 1,2 мкм, відповідно. Для виявлення
вірусних агентів для підготовки проб використовують тільки вакуумну
фільтрацію на фільтри з розмірами пор 0,2 мкм.
Дробне центрифугування. З відібраних зразків переносять по 125,0 мл в 4
центрифужні стакани об’ємом 250,0 мл з кришками (або по 80,0 мл в 6
центрифужних пробірок, або по 50,0 мл в 10 центрифужних пробірок), що
загвинчуються, і центрифугують впродовж 15 хв. при 10000 g. Потім осад в
кожному стакані (пробірці) ресуспендують в 0,2 мл 0,9 % розчину натрію
хлориду. Отримані суспензії переносять в мікроцентрифужні пробірки об’ємом
1,5-2,0 мл і центрифугують при 10000 g впродовж 1 хв. Супернатант
відбирають наконечником з фільтром в мікропробірку об’ємом 1,5 мл. Для
виділення ДНК використовують 0,1-0,2 мл надосадової фракції.
Можливе центрифугування однієї проби в одному центрифужному стакані
(пробірці). Для цього в центрифужний стакан (пробірку) переносять пробу в
об’ємі 50,0-125,0 мл і центрифугують 15 хв. при 10000 g, супернатант
видаляють, і в стакан (пробірку) знову додають відповідний об’єм
досліджуваної проби. Аналогічним чином центрифугують весь об’єм
досліджуваної проби. Потім осад останнього центрифугування ресуспендують
в 1 мл 0,9 % розчину натрію хлориду і центрифугують при 10000 g впродовж 1
хв. Супернатант відбирають наконечником з фільтром в мікропробірку об’ємом
1,5 мл. Для виділення ДНК використовують 0,1-0,2 мл надосадової фракції.
Вакуумна фільтрація. Для дослідження використовують стерильні фільтри
з відповідними розмірами пор. У разі значної забрудненості вихідного зразка
води механічними або масляними домішками, які видно візуально, його
заздалегідь фільтрують на скляній воронці через стерильний ватно-марлевий
або паперовий фільтр. Підготовлену таким чином воду пропускають через
мембранний фільтр. Після закінчення фільтрації мембранні фільтри переносять
стерильним анатомічним пінцетом у стерильний флакон (чашку Петрі) або
стерильний пластиковий пакет об’ємом 100,0 мл, що містять 10,0 мл 0,9 %
розчину натрію хлориду.
Для сорбції (елюції) бактерій і вірусів з фільтру, флакон струшують 10 хв.
за допомогою шейкера, фільтр усередині пакету розтирають вручну впродовж 1
хв., фільтр, поміщений в чашку Петрі, розрізають на дрібні шматки
стерильними ножицями, інкубують при погойдуванні впродовж 10 хв. Далі
елюат з поверхні фільтру переносять в стерильну пробірку. Для дослідження
відбирають 1,0 мл в мікроцентрифужні пробірки об’ємом 1,5 мл і
центрифугують 10 хв. при 10000 g. Для виявлення бактеріальних агентів
залишають 0,1 мл супернатанту, в якому ресуспендують осад. З отриманої
суспензії проводять виділення ДНК. Для виявлення вірусних агентів для
виділення НК використовують 0,1-0,2 мл супернатанту.
З метою збільшення ефективності виявлення вірусів з проб води
(виявлення РНК ентеровірусів) проводять додаткову концентрацію елюатів за
допомогою ультрацентрифугування або обробляють елюати
поліетиленгліколем 6000 (ПЕГ 6000).
Ультрацентрифугування елюату проводять при 40000-50000 g протягом
2 год. з використанням кутових або бакет-роторів. В стерильну центрифужну
пробірку наливають вірусвмістний елюат, а потім за допомогою шприца на дно
пробірки нашаровують 10-20 % розчин сахарози так, щоб вона займала 5-10 %
від об’єму пробірки. Після центрифугування супернатант видаляють. Осад
ресуспендують в 0,5 мл стерильної дистильованої води для ПЛР-досліджень.
Обробка елюату поліетиленгліколем 6000 (ПЕГ 6000). До елюату додають
ПЕГ 6000 і хлористий натрій, що знаходиться безпосередньо в пробірках для
центрифугування, до кінцевих концентрацій 10 % і 0,5 М відповідно. Суміш
ретельно перемішують до розчинення ПЕГ і витримують протягом 10-12 год.
при 4 °С. Суспензію, що утворилася, центрифугують при 10000 g протягом 1
год. або при 6000 g протягом 2 год. Супернатант видаляють, а осад
ресуспендують в 0,5 мл стерильної дистильованої води для ПЛР-досліджень.
Обробка проб. Для видалення бактеріальної мікрофлори елюат піддають
обробці одним з двох методів: хлороформом або фільтрацією через
стерилізуючі насадки з фільтрами.
При використанні хлороформу його додають в елюат (1 мл на 10 мл
елюату), інтенсивно струшують 10 хв. і центрифугують 10 хв. при 1000 g для
розділення фаз. Водну фазу (верхню) акуратно відбирають піпеткою в
стерильний флакон, додають 100 МЕ/мл пеніциліну і 10,0 мг/мл стрептоміцину.
При використанні стерилізуючих насадок з фільтрами 0,22 мкл елюату
проби переносять в стерильний шприц об’ємом 5,0-20,0 мл зі встановленою
фільтруючою насадкою і поршнем шприца продавлюють в стерильний флакон.
Цей спосіб дозволяє уникнути використання антибіотиків, токсичного
хлороформу і пов’язаних з цим заходів безпеки, не вимагає тривалого
струшування і центрифугування.


5. Попередня обробка та знезараження матеріалу, підозрілого на вміст
мікроорганізмів I-IV груп патогенності
Досліджуваний матеріал може бути представлений чистими культурами
мікроорганізмів, біологічним або секційним матеріалом від людини і тварин,
комахами, харчовими продуктами, змивами з поверхонь, фільтратами ґрунту і
т.д.
Обробка досліджуваного матеріалу, інфікованого (підозрілого на
інфікування) бактеріями I-IІ груп патогенності та збудниками глибоких мікозів
Обробка досліджуваного матеріалу, інфікованого (підозрілого на
інфікування) мікроорганізмами I-II груп патогенності (бактеріями, що не
утворюють спори, хламідіями, рикетсіями та збудниками глибоких мікозів),
проводиться наступним способом:
До досліджуваного зразка додають мертиолят натрію до кінцевої
концентрації 1:10000 (0,01 %) і прогрівають його при 56 °С протягом 30 хв.
Потім, 100 мкл зразка переносять в мікроцентрифужні пробірки об’ємом 1,5 мл,
додають лізуючий розчин, приготовлений на основі 6 М гуанідінізотіоцианату,
в об’ємі, зазначеному в інструкції по застосуванню до набору реагентів та
інкубують 15 хв. при 65 °С. Після виконання даних процедур матеріал
вважається знезараженим.
Обробка досліджуваного матеріалу, інфікованого (підозрілого на
інфікування) мікроорганізмами III-IV груп патогенності (вірусами, хламідіями,
рикетсіями і бактеріями, що не утворюють спор) проводиться одним з таких
способів:
Спосіб 1. Прогрівання досліджуваного зразка при 100 °С протягом 30 хв.
Спосіб 2. До 100 мкл досліджуваного зразка додають лізуючий розчин,
приготовлений на основі 6 М гуанідінізотіоціаната в об’ємі, зазначеному в
інструкції по застосуванню до набору реагентів (тест-системи) з подальшою
його інкубацією протягом 15 хв. при 65 °С.
Після виконання процедури за вказаними способами матеріал вважається
знезараженим.
Обробка досліджуваного матеріалу, інфікованого (підозрілого на
інфікування) спороутворюючими бактеріями II-IV груп патогенності
Досліджуваний матеріал в кількості 0,1 мл засівають у пробірки з 0,9 мл
бульйону Хоттингера, рН 7,2 і інкубують з аерацією при 37 °С протягом 2,5
год. Додають пеніцилін до кінцевої концентрації 1000 од./мл і інкубують при 37
°С протягом 15 хв. Після інкубації з пеніциліном, досліджуваний матеріал
прогрівають на водяній бані протягом 10 хв. при температурі 100 °С. Потім
100 мкл обробленого зразка переносять у пробірки об’ємом 1,5 мл і додають
лізуючий розчин, приготовлений на основі 6 М гуанідінтіоізоціаната в об’ємі,
зазначеному в інструкції по застосуванню до набору реагентів, і інкубують 15
хв. при 65 °С. Після виконання даних процедур матеріал вважається
знезараженим.
Обробка досліджуваного матеріалу, інфікованого вірусами I-II груп
патогенності (крім вірусу віспи), що містить інфекційну (позитивну) РНК
Матеріал (100 мкл) поміщають в пробірку об’ємом 1,5 мл, додають 500 мкл
лізуючого буфера на основі 6 М гуанідінізотіоціаната і фенолу (1:1), і
інкубують 20 хв. при температурі 65 °С. Потім виділяють РНК,
використовуючи метод нуклеосорбції на силікагелі, починаючи з етапу
додавання сорбенту, або метод осадження РНК етанолом в присутності 0,3 М
ацетату натрію. Зворотну транскрипцію виконують згідно з інструкцією із
застосування до набору реагентів. Потім у зразки з кДНК додають РНКазу А
до кінцевої концентрації 25 мкг/мл. Після виконання даних процедур матеріал
вважається знезараженим.
Обробка досліджуваного матеріалу, інфікованого (підозрілого на
інфікування) вірусами I-II груп патогенності, що містять неінфекційну
(негативну) РНК або ДНК
Матеріал (100 мкл) поміщають в пробірку об’ємом 1,5 мл, додають 500 мкл
лізуючого буфера, на основі 6 М гуанідінізотіоціаната і фенолу (1:1) і
інкубують 20 хв. при температурі 65 °С. Після виконання даних процедур
матеріал вважається знезараженим.
Обробка досліджуваного матеріалу, підозрілого на інфікування
високопатогенним невідомим збудником, проводиться відповідно до описаних
способів обробки матеріалу, підозрюваного на вміст збудників (бактерій і
вірусів) особливо небезпечних інфекцій. Робота з таким матеріалом, на всіх
етапах дослідження, здійснюється із застосуванням спеціальних засобів
індивідуального захисту.
Знезараження залишків досліджуваного матеріалу здійснюють відповідно
до ДСП №9.9.5.035-99 і ДСП №9.9.5.080-02.
6. Порядок знезараження та утилізації відпрацьованого досліджуваного
матеріалу та відходів після проведення досліджень
Залишки інфікованого матеріалу (з підозрою на інфікування)
мікроорганізмами I-IV груп патогенності, використаний посуд, після
дезінфекції регламентованими дезінфікуючими засобами (якщо є необхідність)
збирають в закриті ємкості (контейнери) та передають на автоклавування. Не
допустимо зливати заражені рідини в каналізацію.
Дезінфікуючі розчини, після обробки ними досліджуваного матеріалу і
закінчення часу їх експозиції, зливають в каналізацію, відкриту ємність з
обробленим матеріалом поміщають в щільний термостійкий пакет (контейнер)
для подальшого автоклавування під тиском 2,0 кгс/см2
(0,2 МПа) при
температурі (132±2) °С протягом 60 хв.
Після автоклавування пакет з інактивованим матеріалом виносять у
контейнер для сміття з подальшим вивезенням на полігон побутових відходів
або на спалювання в спеціальних печах.
Знезараження пробірок з ампліконами, витратних матеріалів, рукавичок
Використані пробірки з ампліконами, наконечники, рукавички, ганчір’я для
обробки поверхонь в боксі біологічного захисту або ПЛР-боксі збирають у
пластикові ємкості, які закриваються, виносять до «брудної» зони ПЛР-
лабораторії з метою подальшої інактивації.
При її відсутності відходи переносять у спеціально-призначене допоміжне
приміщення, де проводять їх інактивацію.
Утилізацію залишків розчинів, що містять гуанідінізотіоціанат,
здійснюють шляхом їх двадцятиразового розбавлення водою з наступним
зливом рідини в каналізацію.
У «брудній» робочій зоні або при її відсутності у допоміжному приміщенні
використані наконечники, пробірки з ампліконами (не відкривати), рукавички,
ганчір’я після закінчення роботи поміщають в щільний термостійкий пакет
(контейнер) для подальшого автоклавування при температурі (132±2) °С
протягом 60 хв.
Дезактивація буферів і гелів, що містять бромистий етидій
Перший спосіб: відпрацьовані гелі та буфер з камери поміщають у
пластикову ємкість на 5 л з кришкою, що щільно загвинчується. Додають 1
об’єм 0,5 М розчину калію перманганату і потім 1 об’єм 2,5 М соляної кислоти.
Акуратно перемішують і залишають при кімнатній температурі на 4-6 год.
Додають 1 об’єм 2,5 М натрію гідроксиду, акуратно перемішують.
Нейтралізовані таким чином реактиви скидають в каналізацію.
Необхідні реагенти для обробки 1 л буфера і гелів: 0,5 М перманганат
калію – 1 л; 2,5 М соляна кислота – 1 л; 2,5 М NaOH – 1 л.
Другий спосіб: обробку розчинів (буферів), що містять бромистий етидій
здійснюють шляхом додавання до них деконтамінуючого розчину до його
кінцевої концентрації 25 % (наприклад, 25 мл деконтамінуючого розчину
додати до 75 мл розчину, що містить бромистий етидій), акуратно
перемішують і залишають при кімнатній температурі протягом 20 год. Розчин
нейтралізують (рН між 5-9) натрієм бікарбонатом. Нейтралізовані розчини
зливають в каналізацію.
Обробку твердих матеріалів, які містять бромистий етидій (наконечники і
гелі) здійснюють шляхом розміщення їх у пластмасову ємкість з
деконтамінуючим розчином. Далі процедуру виконують як при деконтамінації
розчинів (буферів), що містять бромистий етидій.
Приготування деконтамінуючого розчину: додати 20 мл 50 %
гіпофосфорної кислоти до розчину, що містить 4,2 г натрію нітриту в 300 мл
дистильованої води, акуратно перемішати. Розчин використовують у день
приготування.
Третій спосіб: заповнити колонку активованим вугіллям і пропускати
відпрацьований буфер через неї невеликими порціями. Дезактивований розчин
можна зливати в каналізацію. Гелі дезактивувати першим способом.
Необхідні реагенти: скляна колонка місткістю 1-2 л; активоване вугілля.


Нормативні посилання:
Закон України «Про забезпечення санітарного та епідемічного
благополуччя населення»
Закон України «Про захист населення від інфекційних хвороб»
Постанова Кабінету Міністрів України від 22.06. 99 № 1109 «Про
затвердження Положення про державний санітарно-епідеміологічний нагляд в
Україні»
Наказ МОЗ України від 04.01.2001 № 1 «Про затвердження форм медичної
облікової документації, що використовується в лабораторіях»
ДСП № 9.9.5.035-99 «Безпека роботи з мікроорганізмами I-II груп
небезпеки»
ДСП №9.9.5.080-02 «Правила влаштування і безпеки роботи в лабораторіях
(відділах, відділеннях) мікробіологічного профілю»
ДСанПіН 9.9.5-153-2008 «Організація роботи лабораторій при дослідженні
матеріалу, що містить патогенні агенти молекулярно-генетичними методами»
Державні санітарні норми та правила ДСанПіН 2.2.4-171-10 «Гігієнічні
вимоги до води питної, призначеної для споживання людиною»
Методичні вказівки МВ 9.9.5.101-2003 «Застосування полімеразної
ланцюгової реакції для виявлення збудників інфекційних захворювань людини»
Методичні вказівки «Санітарно-вірусологічний контроль водних об’єктів»,
затверджені наказом МОЗ України від 30.05.2007 № 284
Методичні вказівки «Санітарно-мікробіологічний контроль якості питної
води», затверджені наказом МОЗ України від 03.02.2005 № 60
ДСТУ ISO 5667-6-2001 «Настанови щодо відбирання проб води з річок та
інших водотоків»
ДСТУ ISO 5667-11-2005 «Настанови щодо відбирання проб підземних вод»
Інтернетресурс
http://emergency.cdc.gov/urdo/pdf/SpecCollectionGuidelines.pdf
СПИСОК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ ТА СКОРОЧЕНЬ:
CMV – Cytomegalovirus – цитомегаловірус
EBV – Epstein-Barr virus – вірус Епштейна-Барр
EDTA-K3 – Ethylenediaminetetraacetic acid threepotassium salt – трикалієва
сіль етилендиамінтетраоцтової кислоти
EIEC
– Enteroinvasive Escherichia coli –eнтероінвазивні кишкові
палички
НАV – Hepatitis A virus – вірус гепатиту A
HBV – Hepatitis B virus – вірус гепатиту В
HCV – Hepatitis C virus – вірус гепатиту С
HDV – Hepatitis D virus – вірус гепатиту D
НЕV – Hepatitis E virus – вірус гепатиту E
HGV – Hepatitis G virus – вірус гепатиту G
HHV-6 – Human herpes virus type 6 – вірус герпесу людини 6 типу
HPV – Human papilloma virus – папіломавірус людини
HSV I – II – Herpes simplex virus type I-II – вірус простого герпесу І та ІІ
RSV – Respiratory syncytial virus – респіраторно-синцитіальний вірус
SARS – Severe acute respiratory syndrome – тяжкий гострий
респіраторний синдром
VZV – Vaticella zoster virus – вірус варіцелла зостер
ВІЛ – вірус імунодефіциту людини
ДНК – дезоксирибонуклеїнова кислота
ККГЛ – конго-кримська геморагічна лихоманка
БПА – біологічні патогенні агенти
ВКЕ – вірус кліщового енцефаліту
ЛЗН – лихоманка Західного Нілу
НК – нуклеїнові кислоти
ОКО – негативний контрольний зразок
кДНК – компліментарна дезоксирибонуклеїнова кислота
РНК – рибонуклеїнова кислота
РНК-аза – фермент, який руйнує рибонуклеїнову кислоту
УПМ – умовно-патогенні мікроорганізми
 Начальник Управління громадського здоров’я А.А. Григоренко

Comments are closed.